Por Eric Meunier

synbiowatch.org

Varias técnicas de modificación genética (las nuevas técnicas de mejoramiento genético, NBT por sus siglas en inglés) son motivo de discusión en varias partes del mundo para decidir si deben ser considerados los productos obtenidos como transgénicos y someterlos a las normas de regulación o no. Después de una audiencia parlamentaria en Francia el pasado mes de abril de 2016 [1], Inf’OGM trata de descubrir algunos de los riesgos potenciales relacionados con el uso de cualquier técnica de modificación genética realizada en los cultivos de células vegetales.

Las técnicas de modificación genética, tanto las viejas como las nuevas, no están completamente dominadas: si bien permiten dar un organismo vivo un nuevo rasgo ( como la tolerancia a los herbicidas), también se producen modificaciones inesperadas, efectos fuera de objetivo, causados por las mismas técnicas de modificación genética, ya que no afectarían solamente a un área determinada del genoma, y efectos no deseados ( como mutaciones y mutaciones epigenéticas, también denominadas epimutaciones) debido a otras técnicas implementadas durante las diferentes etapas del proceso.

El 6 de abril de 2016, al repetir los comentarios de Yves Bertheau realizados a finales de 2015 ( ex miembro del Consejo Superior de Biotecnología de Francia [HCB]) después de haber dimitido, Jean-Christophe Pagès, Jefe del Comité Científico de HCB para la evaluación de CRISPR/Cas9, dijo que “no hay que olvidar las dificultades de su utilización […] especialmente en relación con el uso in vivo en animales para proporcionar una matriz y por lo general hay que enfrentarse a cuestiones relacionados con el proceso de inserción en la célula. El cultivo in vitro es mucho más sencillo motivo por el cual se usa mayoritariamente en investigación,motivo por el cual los organismos se regeneran mediante el cultivo in vitro. Y esto, efectivamente, concierne a algunas plantas…”. Se trata de una sorprendente observación, sobre todo después de una cuidadosa lectura del documento del comité científico del HCB con fecha del 4 de febrero de 2016, ahora reducido a un informe provisional después haber sido presentado por el Comité Científico, tras lo cual el Gobierno francés no plantea tales dificultades de los cultivos in vivo, ni facilita los in vitro.

Inf’OGM va a proporcionar una serie de dos artículos para ofrecer una visión general de los efectos no deseados e incontrolados que se producen a lo largo de los procesos de modificación genética. En este primer artículo nos centramos en el proceso de inserción, citado por Jean-Christophe Pagès, con el objetivo de introducir en una célula el material necesario para producir la pretendida modificación genética. También nos centraremos en los pasos preliminares que generan un exceso de estrés y, por tanto, puede inducir mutaciones y mutaciones epigenéticas (véase el recuadro que aparece a continuación).

En próximos artículos nos ocuparemos de unos cambios inesperados denominados “off-targets” (fuera de objetivo) debido a las técnicas NBT. Se citarán varios artículos científicos para que el lector pueda profundizar en los detalles.

Mutación, mutación epigenética (epimutación)= ¿qué es? Una mutación se define generalmente como un cambio en la información genética de un organismo, ya sea en su ADN o ARN. Las mutaciones son hereditarias. Se puede producir un silenciamiento, es decir, sin consecuencias observables en el metabolismo del organismo. También puede cambiar la expresión de uno o varios genes, modificando el metabolismo. Las mutaciones epigenéticas pertenecen a la clase de mutaciones que afectan a la expresión de una secuencia genética, pero que no se debe a un cambio en la secuencia de nucleótidos. Puede ser debido a un cambio en la composición química de los nucleótidos del ADN o de la cromatina.

Preparación de las células para su transformación

Antes de introducir un material genético en la célula ( o sea el proceso de inserción al que se refería Jean-Christophe Pagès), hay que dar un primer paso: la preparación de la célula. Los trabajadores del laboratorio tendrán que romper las células de la pared celular, incluso quizás haya que eliminarlas por completo. Las células vegetales sin paredes celulares, llamadas protoplastos, ya pueden ser manipuladas por los ingenieros genéticos para introducir en esas células herramientas tales como proteínas (como Cas9), ARN y o ADN codificantes. Pero, como explica Yves Bertheau, este proceso de producción de los protoplastos induce mutaciones y epimutaciones, un fenómeno ampliamente observado según la literatura científica [2].

El cultivo celular induce mutaciones

El segundo paso es el del cultivo celular. Pero el cultivo de células también produce mutaciones y mutaciones epigenéticas. La literatura científica muestra que, sorprendentemente, los mecanismos mediante los cuales aparecen esas mutaciones y mutaciones epigenéticas son aún poco conocidos a pesar de las décadas de utilización [3]. Este fenómeno, conocido como variación somaclonal, fue utilizado previamente por las empresas de semillas para crear la diversidad genética necesaria para reproducir las plantas, de acuerdo con el lenguaje que habitualmente utilizan las compañías de semillas. La Asociación Francesa de Semillas y Plantas (GNIS, una organización de financiación privada que ofrece servicios públicos) señala que “la variación somaclonal es la modificación observada en algunas células después de un largo ciclo de cultivo in vitro sin regeneración. Por lo tanto, no serían idénticos a la planta madre. Esta variación puede deberse a una modificación del genoma del núcleo o en el genoma de los plástidos del citoplasma” [4].

En otras palabras, las plantas obtenidas a partir de esas células cultivadas in vitro tienen unas características diferentes. GNIS ofrece un interesante último detalle: “Las modificaciones obtenidas y la presencia de nuevos rasgos son muy inestables y no siempre se encuentran en la planta regenerada o en su progenie”. ¿Por qué? La aparición de otras modificaciones (mutaciones epigenéticas) puede hacer que esas modificaciones desaparezcan… [5] Como nos dice Yves Bertheau: “en tales condiciones parece bastante difícil prever el impacto del cultivo celular en la utilización de una nueva técnica de modificación genética”.

El proceso de inserción también se denomina vectorización

Una vez que las células son preparadas y cultivadas, ya es posible insertar el material biológico para producir la modificación genética. Dependiendo de las técnicas, este material puede estar constituido por proteínas y/o secuencias genéticas tales como ARN o ADN codificantes (oligonucleótidos, plásmidos, virus,…), que son las moléculas más frecuentemente utilizadas en las plantas. Insertar este material en la célula necesita la realización de grandes orificios en las membranas (citoplasmática y nuclear) de la célula. Pero como nos explica Yves Bertheau, tales orificios inducen mutaciones y epimutaciones [6]. Resulta por tanto, muy difícil trazar un cuadro general de la evaluación de riesgos. Hay que elegir entre varias técnicas de inserción, entre diferentes tipos de material, entre las secuencias genéticas a introducir y las especies objetivo. Sólo un análisis de caso por caso de dichos transgénicos permitiría evaluar todos los riesgos potenciales relacionados con los efectos no deseados.

El Informe provisional de comité científico del HCB no dice nada acerca de estas mutaciones

En un artículo científico publicado en el año 2011, los científicos estimaron que el 35% de todos los efectos no deseados observados al realizar modificación genética mediante transgénesis en el arroz Senia se debieron al proceso mismo de modificación [7]. Por lo tanto, no se trata de un fenómeno nada despreciable.

Sorprendentemente, y pese a la audiencia en la Oficina Parlamentaria de Evaluación de Asuntos Científicos (OPECST), el Comité Científico del HCB no se ocupó de esos riesgos en su informe provisional y su relación con las nuevas técnicas de modificación genética [8]. Si el proceso de inserción se describe en el apéndice para cada una de las técnicas es sólo para delinear las herramientas utilizadas en cada una de las técnicas y para describir cómo se introduce el material en las células. No se habla de las posibles mutaciones y epimutaciones derivadas de los diferentes pasos de modificación. Dado que el Comité Científico del HCB se encarga de la evaluación de riesgos para el Gobierno francés, era de esperar que este Comité debatiera y diera explicaciones para no dejar de lado estas cuestiones documentadas. Sobre todo considerando que el proceso de modificación, para referirnos al único punto en el que se hace referencia en el informe provisional, no parece estar totalmente controlado en ninguna de las técnicas utilizadas. El Comité científico afirma incluso que con la técnica denominada de mutagénesis dirigida mediante oligonucleótidos (ODM), “muchas moléculas o mezclas moleculares se están probando actualmente para mejorar el proceso de inserción, que funciona bastante bien in vitro, pero no así sobre los organismos completos (Liang et al., 2012)” [9]…

Referencias:

[1] Inf’OGM, “CRISPR/Cas9: ¿Ineficaz en salud pero bueno para su uso en agricultura?”, 2 de mayo de 2016.

[2] “Estrés inducido en las células somáticas de las plantas para adquirir algunas características de las células madre acompañadas de la reorganización selectiva de la cromatina”, Florentin, A. et al. (2013), Developmental Dynamics, 242 (10), 1121-1133;

“La especificidad de la etapa evolutiva y el papel del metabolismo mitocondrial en la respuesta del genero Arabidopsis genera un estrés osmótico leve pero prolongado”, Skrycz, A, et Al., (2010). Plant Physiology, 152 (1), 226-244;

“Protoplastos del mesófilo de plantas de arabipdosis: un sistema celular versátil para el análisis transitorio de la expresión génica”, Yoo, S.-D. Et al., (2007). Nat. Protocolos, 2 (7), 1565-1572.

[3] “El cultivo celular induce una frecuente y gradual reprogramación epigenética generando variantes alélicas llamadas “epialelos” en el tabaco”, Krizova, K. Et al., (2009. Plant Physiology, 149 (3), 1493-1504;

« Extended metAFLP approach in studies of tissue culture induced variation (TCIV) in triticale », Machczyńska, J. et al., (2014). Molecular Breeding, 34(3), 845-854 ;

« Tissue culture-induced novel epialleles of a Myb transcription factor encoded by pericarp color1 in maize», Rhee, Y. et al., (2010). Genetics, 186(3), 843-855 ;

« Transformation-induced mutations in transgenic plants : analysis and biosafety implications », Wilson, A.K. et al., (2006). Biotechnol Genet Eng Rev, 23(1), 209-238 ;

« A whole-genome analysis of a transgenic rice seed-based edible vaccine against cedar pollen allergy », Kawakatsu, T. et al., (2013).. DNA Research 20, 623-631 ;

« Recent progress in the understanding of tissue culture-induced genome level changes in plants and potential applications », Neelakandan et al.,, 2012,. Plant Cell Reports, 31(4), 597-620;

[4] http://www.gnis-pedagogie.org/biotechnologie-amelioration-introduction-caractere.html

[5] « Meiotic transmission of epigenetic changes in the cell-division factor requirement of plant cells », Meins, F. et al., (2003). Development, 130(25), 6201-6208.

[6] « Cell biology : delivering tough cargo into cells », Marx, V. (2016). Nat Meth, 13(1), 37-40.

[7] « Only half the transcriptomic differences between resistant genetically modified and conventional rice are associated with the transgene », Montero, M. et al., (2011). Plant Biotechnology Journal, 9(6), 693-702.

[8] Inf’OGM, « FRANCE – Cacophonie au HCB sur les nouvelles techniques de transformation du vivant », 9 février 2016